（1）组织分离法：组织分离法是指采用食用菌子实体或菌核、菌索的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。
（2）菇木分离法：又称为耳木分离法、寄主分离法、基质分离法，是从生长食用菌的菇木或耳木中获得纯菌丝体的方法。菇木分离培养的菌种一般生活力都较强。在实际生产中，由于这种方法污染率高，所以能用组织分离或孢子分离获得菌种的菇类一般都不采用此法。
（3）孢子分离法： 孢子分离法是用食用菌成熟的有性孢子（担孢子或子囊孢子）萌发培养成菌丝体而得到菌种的方法。食用菌的有性孢子具备双亲的遗传特性，变异的机会多，生命力强，培育成的菌种质量好。有性孢子是选育优良新品种和杂交育种的好材料。但分离方法复杂。
在生产上最常用的是组织分离方法，该方法属无性繁殖，简便易行，菌丝生长发育快，能保持原有性状。此法是大多数食用菌进行菌种分离的最简便又有效的方法，也是人们在野外分离菌种最常采用的简便方法。在生产上常被用于菌种的复壮、新品种的选育和栽培种优良性状的稳定。
食用菌菌种分离方法有多种，常用的方法包括：
1. 剪切分离法：将食用菌菌丝均匀地切割成小块，然后将其分别接种在含有适宜培养基的培养皿上，利用菌丝的生长特性进行分离。
2. 稀释分离法：将食用菌菌丝均匀地切碎，然后将其悬浮在适宜培养基中，通过逐渐稀释的方法将菌丝分散在培养基上，使得每个培养皿上只有一个菌落。
3. 筛选分离法：将食用菌菌丝均匀地涂布在含有筛选剂的培养基上，筛选剂可以抑制其他细菌或真菌的生长，从而使得食用菌菌落能够单独生长。
4. 纯培养法：将食用菌菌丝均匀地切碎，然后将其接种在含有适宜培养基的培养皿上，通过多次传代培养，将菌丝分离出纯种。
5. 单孢分离法：通过显微镜观察，选择单个孢子或孢子团，将其分离接种在含有适宜培养基的培养皿上，培养出单孢菌落。
这些方法可以根据具体的实验目的和食用菌的特性选择合适的分离方法。同时，为了确保分离的准确性和纯度，还需要注意无菌操作和适宜的培养条件。
