第一展厅：大运河的开凿与变迁
进入展厅，有一组单色群雕——运河的开凿者。开凿大运河是中国古代劳动人民的伟大创造，凝聚了劳动人民的智慧和血汗。从文献上记载来看，中国大运河的历史可以追溯到两千五百多年前的春秋战国时期，当时吴国的国王夫差为了北上争霸，开凿了从邗城到末口的邗沟。在“古运河图”中可以清楚看到，在公元前486年，吴王夫差开凿的邗沟，从末口到邗城（即今天的扬州到淮安）一段，全长150公里，是最早就文字记载的一条人工河道。
用人物雕像、历史图片展现运河连接中国五省四市、贯通五大水系，波澜起伏的历史故事。第一展厅中有一把考古出土的春秋战国时期的青铜戈，距今已有二千四百多年历史，是博物馆中年代最早的一件文物。
第二展厅：大运河的利用
开凿大运河最初是为了军事目的。吴王夫差要北上争霸，为了运输人马和粮草，所以开凿了邗沟。但是到隋唐以后，大运河的功能更多的体现在经济方面。有一张船票特别有意思。是清朝末年的一张船票，上面印有“顺风快利”四字，表达了商家希望一帆风顺，早日获利的美好希望。还写明了收款的一些项目清单，以及提醒顾客保存好随身所带行李的提示等。既是明白消费，又有温馨提醒。 从隋朝，唐朝，宋朝，元朝，一直到明清两朝，建都在北方的中央政府都需要江南地区的漕粮供应。大运河在一定程度上，承载着一个庞大的漕运帝国，对中央政权的稳定，起到了关键的作用。
展厅内最具历史价值的是清代“苏州府”官斛，这种木制锥形器皿，是当时政府向百姓收粮用的一种计量工具，过去运河上都是漕船载粮，交粮时将米由舱内取出用斛量，叫“起米过斛”。一斛相当于五斗，约三十五点八公斤。还有一幅七百多平方米的环形银幕，十八台投影仪播放着当年运河漕运宏大场面，气势壮阔。
第三展厅：大运河（浙江段）申遗陈列厅
本展厅从浙江段运河的河道变迁、遗产价值、保护规划等方面进行展示。浙江段堪称“活着的文化遗产”，是跨流域的大型水运体系，涉及太湖、钱塘江、曹娥江、甬江等自然水域，构成复杂，迄今仍承担着繁重的航运任务。
展厅地上是一条流动的运河，闪闪发光。原来，这里用微缩模型做出了大运河及两岸的九座城市，放在玻璃地面下。第三展厅还有个“模拟运河之旅船舱”，坐进去，能看到实景拍摄的大运河沿途风光。
第四展厅：运河文化
山东聊城面塑、江苏扬州剪纸、江苏无锡泥人等运河边城市代表物品摆放到一起，足见大运河孕育出的两岸文化之丰富。
