一群草食人猿正在广袤无际的非洲沙漠中觅食，当他们从睡梦中醒来，发现一块巨大的黑色石板平地而起，他们欢呼雀跃起来，在巨石的指引下，他们学会将骨头当作工具和武器，开始猎食动物，并收复了同类抢占的失地，随着他们的首领将骨头抛向空中，画面切换至数百万年后的未来。
2000年，海伍德·弗洛伊德博士前往人类的月球基地，奉命调查月球上的不明物体，那是一块被埋藏了数百万年的黑色石板，与远古时期人猿们发现的石板相仿。在弗洛伊德等人进行实地考察时，太阳升至石板上空，石板随即发出了刺耳的无线电信号。
18个月后，“发现一号”太空船向木星进发，除了飞行员大卫·鲍曼和弗朗西斯·普尔之外，飞船上还有三名处在冬眠状态的科学家和一台具有人工智能、掌控整个飞船的电脑“哈尔”9000。飞行途中，哈尔突然向鲍曼报告控制通讯装置的某个零件将在72小时内发生故障，可经过检测之后，鲍曼和普尔发现哈尔所说的故障零件一切正常，他们与地面控制中心取得联系，得出了哈尔作出错误预测的结论，两人震惊不已，因为哈尔9000型电脑从未出过任何差错。
鲍曼和普尔开始质问哈尔，而哈尔建议将零件放回原处以观后效。为了避免让哈尔偷听到谈话内容，鲍曼和普尔躲进太空舱中交谈，普尔坦言感觉不妙，认为如果一旦证实哈尔出错，就必须将其关闭。两人万没想到，虽然哈尔听不到他们的声音，却可以透过窗口读取唇语。
哈尔决定先发制人，他用太空舱撞断了正在更换零件的普尔的氧气管，令其漂浮在太空中。鲍曼出舱营救，而冬眠的三位科学家随即因电脑失灵而悉数丧生。哈尔拒绝为返回的鲍曼打开舱门，万般无奈之下，鲍曼冒着患上减压病的危险通过紧急密封舱进入飞船，直奔哈尔的逻辑记忆中枢，当哈尔被彻底关闭时，鲍勃发现飞船已经飞抵木星。
鲍勃乘太空舱驶离飞船，在木星轨道上发现了又一块黑色石板，接近石板的鲍勃突然高速穿过一条五彩斑斓的隧道，最终置身于一间风格古朴华丽的卧室。鲍勃迅速老去，在垂死之际，第四块石板出现在床边，石板将他变成透明光团中的胎儿——星孩，星孩凝视着浩瀚的宇宙，等待未知新生的到来。
