电影设定于第二部剧情发生的三年后，彼得·派克继续蜘蛛侠英雄使命时，其恋人玛莉·珍·沃森则继续她的演艺事业，昔日挚友哈利·奥斯本变成新一代绿魔，开始追杀彼得来为父报仇。电影同时首次介绍两位蜘蛛侠的新敌人：沙人和毒液：致命守护者，同时介绍蜘蛛侠的另一名恋人格温·斯黛西。
剧情：彼得·派克自从被恋人玛莉·珍·沃森发现自己的“蜘蛛侠”身份后，如今跟她交往三年而准备向她求婚。就在玛莉·珍刚在百老汇剧院初演完成后，彼得和她在中央公园里赏流星雨时，未注意到一颗小型陨石落至他们附近。
与此同时，一位刚越狱的逃犯佛林特·马可，回家见他身患绝症的女儿潘妮一面，随后继续逃亡却不慎掉进实验重地，受粒子加速器实验影响而身体发生分解，跟周围的沙子融合后变成能自由变形的“沙人”。
后来，格温的父亲兼纽约市警察队长乔治·斯黛西向彼得和梅婶汇报说，马可才是五年前抢车并枪杀班叔的真凶，而抢钱的丹尼斯·卡雷汀只是帮凶。愤怒的彼得收听警用频道追寻马可过程中，共生体偷偷爬入穿着蜘蛛侠战服的彼得身上，跟其混合后将战服变为黑色并增强彼得的实力。
然而，共生体同时黑化彼得的善良心灵，使他着装黑战服跟着抢完钱的马可至下水道。得知水是马可的弱点后，彼得打开水管将马可分解并冲走，认为他已为班叔报完仇。
玛莉·珍的演艺事业刚好一落千丈，失落的她找出院的哈利独处乃至亲吻，最后她不想背叛彼得而离开。受爱情打击的哈利因此恢复记忆，在父亲幻觉督促下继续他的复仇，以彼得的性命来威胁玛莉·珍忍痛跟他分手。在听完玛莉·珍分手是因为“爱上某人”后，彼得发现是哈利搞鬼而换上黑战服，跑到哈利的顶层公寓一决高下。
后来，他来到报社以确凿证据公开艾迪的造假行为后，总编J·乔纳·詹姆森愤怒地将艾迪开除，一切顺心让彼得认为这件黑战服是天赐。同时，马可成功克服怕水弱点，存活下来并逃出下水道。为了让玛莉·珍嫉妒，彼得将格温约至玛莉·珍如今工作的夜间俱乐部，当格温领略到彼得的企图后便离开，而彼得因为在夜店里的小争执，无意间打到玛莉·珍。
彼得霎那间发现自己变得残暴无常，在教堂顶上为了摆脱共生体，利用教堂钟声的强大声波来干扰共生体且将其撕下来。这时，身败名裂的艾迪来到教堂里祈祷能杀死彼得时，听见彼得的喊声后来到钟下方，不仅注意到彼得是蜘蛛侠、还跟落下来的共生体融合后变成邪恶的“毒液：致命守护者”。艾迪随后找到马可来提出合作，杀死蜘蛛侠来达到各自的目的，他随后绑架玛莉·珍、在一座建筑工地高楼上布下黑色蜘蛛网，而底下由变成沙子巨人的马可负责看守。
由于哈利拒绝帮他，彼得只好独自上阵，在一对二的情况下完全不敌并几乎被打死。这时，哈利从曾经处理过父亲遗体的管家伯纳德口中得知，自己父亲死因其实是咎由自取，在觉醒之下搭滑翔翼前来为彼得助阵。彼得对抗毒液：致命守护者途中，哈利成功用导弹制伏马可，随后跟彼得一起救下玛莉·珍。
但二人面对毒液：致命守护者仍处于下风，当毒液：致命守护者准备拿哈利的滑翔翼刀刃刺向彼得时，哈利牺牲自己跳过去挡下刀而受致命伤。彼得找准时机用多数铁柱将毒液：致命守护者罩住，通过敲打声波来让艾迪脱离共生体，当彼得拿出南瓜炸弹扔向毒液：致命守护者时，艾迪不情愿让它毁灭而自行跳过去，最后一起跟共生体炸成灰烬。
恢复人形的马可上前对蜘蛛侠坦述五年前的实情，解释班叔在他抢车时其实曾经劝过他住手而使他一度动摇，后来被搭档丹尼斯推一下导致手里的枪意外走火才杀死班叔。马可表示他五年下来都因这件事饱受煎熬，彼得决定原谅马可的罪行后，让马可化为沙子离去。
重伤的哈利临死之际，跟彼得释尽所有前嫌后最后证明他们的友情，最后死在彼得和玛莉·珍面前。事情之后，哈利被誉为英雄后被安葬，彼得、玛莉·珍、梅婶、格温和管家伯纳德等人均出席。葬礼过后，彼得和玛莉·珍在夜店里正式和解，两人跳着舞并相拥。
