1996年,参演反腐刑侦剧《英雄无悔》,该剧是马少骅首次接触影视剧作品。2000年,在历史革命剧《平民大总统》中饰演孙中山。2002年,在近代历史题材电视剧《走向共和》,饰演孙中山。2005年,参演历史剧《汉武大帝》。2007年,在革命战争剧《浴血坚持》。2009年,出演革命剧《沂蒙》,并凭借该剧提名第28届中国电视剧飞天奖优秀男演员。
2010年,凭借电视剧《外乡人》提名第25届中国电视金鹰奖最佳男演员。2011年,领衔主演史诗献礼剧《辛亥革命》,第三次饰演孙中山一角。2013年,在抗日谍战剧《一个鬼子都不留》。2014年,参演现代题材电视剧《原乡》。2014年,为纪念邓小平诞辰110周年,在重大革命历史题材电视剧《历史转折中的邓小平》中饰演邓小平。2015年,主演丁黑执导的历史题材电视剧《冯子材》。2016年,参演李雪执导的医疗题材都市剧《外科风云》。2017年,主演主旋律文艺电影《匠心》。