圣保禄教堂最早创建于1583年，在1595年和1601年先后发生三次大火而烧毁。教堂于1602年重建，由意大利籍耶稣会会士卡洛斯•斯皮诺拉神父设计，并保留当初1602年重建的奠基石，由于，重建后的教堂是奉献给圣母，又被称为圣母堂，教堂于1603年建成，至于前壁及石阶于1640年才完成，是当时远东最大的天主教石建教堂。
1762年，葡萄牙帝国政府下令没收耶稣会财产，圣母教堂先后被改作军官宿舍、兵营。
1835年1月26日黄昏，教堂的厨房起火，火势过大，最后把教堂烧剩前壁及68级台阶。由于教堂前壁与中国古代的牌坊非常相似，故本地人便称之为“大三巴牌坊”。
1990年代初，政府曾对教堂遗址进行考古调查及修复工作，并发现了当时教堂背后的建筑遗址及埋葬教士的墓地。及后在1996年，政府在该遗址建成了天主教艺术博物馆与墓室，展出不少澳门教会的珍贵文物；同时，也在大三巴牌坊的背部安装了铁架楼梯，以供游人参观，可是楼梯的铁架插了在牌坊的结构之内，此举引来一些文物专家的不满。
在回归前的澳葡政府已欲将牌坊申报为世界文化遗产，但由于政治及技术因素而未能成功。
2005年，中华人民共和国政府成功向联合国教科文组织申报世界文化遗产，大三巴牌坊成为澳门历史城区的一部分。
