RNA提取过程中有哪些关键步骤及注意事项(提取RNA过程中为什么要加热)

RNA提取过程中有哪些关键步骤及注意事项(提取RNA过程中为什么要加热)

首页维修大全综合更新时间:2024-01-21 22:57:11

RNA提取过程中有哪些关键步骤及注意事项

细胞中的RNA主要有三类:rRNA约占80%-85%,tRNA和核内小分子RNA约占10%-15%,mRNA约占1%-5%,由于rRNA占绝大多数,因此我们用琼脂糖凝胶电泳可以看到的即是rRNA,它也有三种类型:28S,18S,5S。所以我们看到的也应该是三条带,而且28S的亮度为18S的两倍。这样的RNA才可以用来建库。在RNA的提取时,一定要注意RNase的污染,因RNA极易被RNase的降解,操作时应尽量少说话,并在洁净的环境中操作,主要防止手、唾液和空气中Rnase的污染;另一方面使用的所有玻璃仪器、移液器、吸头和离心管都用0.5%DEPC溶液处理过夜,然后高压灭菌15分钟.但对于灭菌的一次性使用的塑料制品基本上无RNase,,可以不经处理直接用于提取RNA,实验室用的普通玻璃器皿和塑料制品经常有Rnase污染,使用前必须180度干烤8小时或更长时间(玻璃器皿)或用氯仿冲洗(塑料制品),另外,由于材料不同,机体内含有的糖、酚类物质不一样,因此材料不同用的方法也应该不一样。下面是两种提取方法,第一种适用于嫩组织或动物组织的总RNA的提取,第二种适用于老组织的提取。试剂:提取缓冲液,KAc(5M), 异丙醇,无水乙醇,DEPC水仪器:离心机,恒温水浴锅,研钵 方法一 动物、植物(嫩叶)的总RNA分离 大约2克植物组织或动物组织用液氮研磨↓加5mlTrizol裂解液 ↓12000rpm ,4度,10分钟 ↓加入1ml氯仿 ↓剧烈振荡15秒,室温温育2-3分钟 ↓室温离心10分钟,8000rpm ↓取上清,加入等体积的异丙醇,15-30度放置10分钟。 ↓12000g离心10分钟 ↓弃上清,加入10ml75%洒精洗沉淀。 ↓2-8度下,不超过7500g离心5分钟 ↓弃上清,干燥沉淀10分钟 ↓用DEPC水溶。方法二 、植物老叶、老根或多糖含量高的材料的总RNA分离 1g组织液氮研磨,加入6ML提取缓冲液↓2min振荡↓65℃,20min↓加入1.5MLKAc↓混匀,冰浴20min↓8000rpm,4℃,15min取上清,加入0.6倍异丙醇,-20℃,1小时(或室温15-20min)↓12000rpm,4℃,15min↓75%乙醇,12000rpm,20℃,5min↓晾干,溶60ulDEPC水,15min↓ 12000rpm,4℃,5min, 上清即为RNA。

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