孔雀石绿在水生动物体内迅速代谢成无色孔雀石绿，而无色孔雀石绿的毒性甚至超过孔雀石绿，所以通常将孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量作为动物源性食品中孔雀石绿残留的限量指标。孔雀石绿的检测方法以理化检测法和免疫学检测法为主。其中理化检测法包括：薄层层析法、分光光度法、 高压液相色谱法、液相色谱质谱联用法、气相色谱质谱联用法等，相较之下免疫学检测方法更为常用。
酶联免疫检测法（ELISA）：酶联免疫法的基本原理是将酶分子与抗体分子共价结合，结合产物不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。底物可在酶的作用下使其所含的供氢体由无色的还原型转变成有色的氧化型，出现颜色反应，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈一定的比例，显色反应可通过酶标仪进行定量测定。ELISA方法是一种特异、敏感的检测方法，可分为： 间接竞争抑制法、抗体/抗原包被直接竞争法和夹心法。
其中间接竞争抑制法，是用人工抗原包被酶反应板后加入抗血清和待测药物进行竞争性结合反应，洗涤后板上只留有与包被抗原结合的抗体(一抗) ，再加酶标记物的二抗与一抗结合，洗涤后加入酶的底物。酶催化反应的产物量与被结合的一抗和二抗量呈正比，与待测样品中相应的药物量呈反比。其特点在于一个一抗可结合多个二抗，放大待测物的量，提高了方法的灵敏度。截至2013年的商品ELISA孔雀石绿试剂盒，都只能检测孔雀石绿总量，不能同时检测孔雀石绿和无色孔雀石绿各自的含量，在样品前处理过程中应注意根据抗原和抗体的类型，将目标化合物全部转化成相对应的形态。
