预变性和退火温度怎么确定

pcr预变性的温度和时间是根据所采用的pcr试剂盒说明来确定的，不同的试剂盒，预变性的温度和时间会有稍微的差别，比如有的试剂盒要求的预变性是94℃，5分钟，有的试剂盒要求的预变性是95℃，4分钟等，类似的微小差别。

计算退火温度的方法：

1.退火温度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8）只是粗算，有时不灵，但比较简便。

2.用primer5（oroligo6）计算，引物配对好后，primer5可以显示Tm，我认为这个值就是退火温度，我的经验再加2or3度最好。

3.合成引物的单子上也有个Tm，减去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1计算的。