构建步骤：
1、用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现缺口，露出黏性末端；
2、再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端；
3、将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处；
4、再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键；
5、再加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。
基因表达载体构建的步骤如下：
1. 目的基因获取：在进行PCR之前，需要先针对自己的基因设计对应的引物；提取与所需表达的基因同源的细胞或组织中的RNA，并经过RT程序将其转化为cDNA；PCR扩增出所需要的基因片段。
2. 载体构建：载体构建（vector construction）是分子生物学研究常用的手段之一。依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
3. 挑取克隆提质粒验证：挑取单菌落接种于含载体对应抗性的LB培养液中，200rpm，37℃恒温摇床培养过夜，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行双酶切验证、测序验证。
