底物水平磷酸化（substrate level phosphorylation）：是指物质在脱氢或脱水过程中，产生高能代谢物并直接将高能代谢物中能量转移到ADP(GDP)生成ATP(GTP)的过程。
指在分解代谢过程中，底物因脱氢、脱水等作用而使能量在分子内部重新分布，形成高能磷酸化合物，然后将高能磷酸基团转移到ADP形成ATP的过程。例如在糖的分解代谢过程中，甘油醛-3-磷酸脱氢并磷酸化生成甘油酸-1，3-二磷酸，在分子中形成一个高能磷酸基团，在酶的催化下，甘油酸-1，3-二磷酸可将高能磷酸基团转给ADP，生成甘油酸-3-磷酸与ATP。
底物水平磷酸化
又如甘油酸-2-磷酸脱水生成烯醇丙酮酸磷酸时，也能在分子内部形成一个高能磷酸基团，然后再转移到ADP生成ATP。
又如在三羧酸循环中，琥珀酰CoA（辅酶A）生成琥珀酸，同时伴有GTP的生成，也是底物水平磷酸化。
特点
底物水平磷酸化指高能化合物的放能水解作用或与基团转移相偶联的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸链中氧化磷酸化的ATP生成过程。例如：糖酵解途径中产生的高能磷酸化合物甘油酸-1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基团转移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循环中产生的高能硫酯化合物琥珀酰辅酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同时使GDP磷酸化为GTP，GTP再与ADP作用生成ATP。这些都是底物水平磷酸化的实例。底物水平磷酸化没有共同的作用机制。
